In　this　study,　we　reported　on　a　low　detection　limit　penicillin　biosensor　with　layer-by-layer　(LbL)　film　containing　single-graphene　nanosheets　(SGNs)　preadsorbed　with　hematein,　ionic　liquids　(ILs)　and　penicillinase.　The　penicillinase　catalyzes　the　hydrolysis　of　penicillin　to　penicilloic　acid,　where　H+　is　liberated　and　monitored　amperometrically　with　hematein　as　a　pH　indicator.　The　SGN-hemateinas/penicillinase　biosensor　exhibited　excellent　performance　for　penicillin　in　PBS　with　a　wide　range　from　1.25　x　10(-13)　to　7.5　x　10(-3)　M,　and　a　low　detection　limit　of　10(-13)　M　(0.04　ppt,　S/N　＞=　3).　Furthermore,　the　detection　of　penicillin　concentration　in　real　sample　(milk)　had　acceptable　accuracy　with　the　assay　system.　(C)　2014　Elsevier　B.V.　All　rights　reserved.