d-Allulose　is　considered　an　ideal　alternative　to　sucrose　and　has　shown　tremendous　application　potential　in　many　fields.　Recently,　most　efforts　on　production　of　d-allulose　have　focused　on　in　vitro　enzyme-catalyzed　epimerization　of　cheap　hexoses.　Here,　we　proposed　an　approach　to　efficiently　produce　d-allulose　through　fermentation　using　metabolically　engineered　Escherichia　coli　JM109　(DE3),　in　which　a　SecY　(ΔP)　channel　and　a　d-allulose　3-epimerase　(DPEase)　were　co-expressed,　ensuring　that　d-fructose　could　be　transported　in　its　nonphosphorylated　form　and　then　converted　into　d-allulose　by　cells.　Further　deletion　of　fruA,　manXYZ,　mak,　galE,　and　fruK　and　the　use　of　Ni2+　in　a　medium　limited　the　carbon　flux　flowing　into　the　byproduct-generating　pathways　and　the　Embden-Meyerhof-Parnas　(EMP)　pathway,　achieving　a　≈　0.95　g/g　yield　of　d-allulose　on　d-fructose　using　E.　coli　(DPEase,　SecY　[ΔP],　ΔFruA,　ΔManXYZ,　ΔMak,　ΔGalE,　ΔFruK)　and　8　μM　Ni2+.　In　fed-batch　fermentation,　the　titer　of　d-allulose　reached　≈23.3　g/L.　©