目的：从高温温泉宏基因组中挖掘能够高效催化合成稀有糖的新耐高温D-来苏糖异构酶。方法：从云南昌宁鸡飞温泉底泥中提取宏基因组DNA并进行高通量测序，经基因注释及序列比对鉴定D-来苏糖异构酶基因，构建大肠杆菌异源表达载体并诱导表达，通过亲和层析纯化重组蛋白并对其性质研究。结果：从温泉底泥宏基因组测序结果中鉴定得到8个D-来苏糖异构酶基因，选择4个基因进行异源表达，其中JF-LI1和JF-LI4在大肠杆菌中成功表达并检测到酶活性。研究表明，JF-LI1和JF-LI4的最适温度分别为70℃和75℃。JF-LI4具有较宽的作用温度和良好的热稳定性，在30～100℃的温度范围内剩余40%以上的酶活力。JF-LI1和JF-LI4的最适pH分别为7.0和7.5,在中性偏酸性条件下具有较高的活力和较强的稳定性。重组JF-LI1和JF-LI4具有较宽的底物谱，除了对D-来苏糖活性最高外，对L-核糖、L-核酮糖、D-果糖和D-甘露糖均具有活性。重组JF-LI1和JF-LI4对L-核糖的催化效率分别为0.56　L/(mmol·s~(-1))和0.61　L/(mmol·s~(-1)),是目前已知的D-来苏糖异构酶中最高的。结论：从高温温泉宏基因组中获得8个新的D-来苏糖异构酶基因，对JF-LI1和JF-LI4进行异源表达和性质研究，具有pH稳定性好、热稳定性强以及底物特异性宽泛的特点，在制药、食品、化妆品等工业领域有重要的应用潜力。